转录谱表型筛选平台PHDs-seq，高效发现重编程化合物

    高通量表型筛选（High-throughput phenotypic screening）是干细胞和药物研究的重要方法之一。传统的高通量表型筛选方法包括使用遗传改造的报告系统或通过免疫荧光来检测极少数的生物标志物或单一表型（如细胞增殖、存活率、形态等），但这些方法很难准确且全面的评估细胞的命运或状态；而如果大规模使用qPCR技术，则操作非常繁琐，成本也很难控制，很难达到高通量的检测效果。近年来，也有一些研究报道建立了全转录谱或靶向转录谱的高通量测序方法（如Plate-seq、Drug-seq、TAC-seq等），但利用这些方法开展高通量表型筛选仍存有一些局限，有的操作繁琐、有的成本较高、有的灵敏度不够等。因此，在药物研发和干细胞研究领域急需一个经济有效的高通量筛选方法，同时检测一组（数十至数百个）标志基因的表达量来全面评估小分子药物作用。

    2023年6月2日，北京大学未来技术学院、北大-清华生命科学联合中心赵扬团队和南京昕瑞再生医药科技有限公司合作在《细胞再生》（Cell Regeneration）杂志上发表了题为“PHDs-seq: a large-scale phenotypic screening method for drug discovery through parallel multi-readout quantification”的研究文章。在该研究中，研究人员开发了一种基于探针杂交的高通量靶向测序方法PHDs-seq（Probe Hybridization based Drug screening by sequencing），可以靶向深度检测研究者关注的一组基因的表达。该方法成本低、准确性高、灵敏性高、可重复性高，不依赖于任何特殊仪器，提供了一种理想的高通量表型筛选系统。利用PHDs-seq方法，研究人员选择了一组和人真皮成纤维细胞的命运重编程相关的标志基因，利用人真皮成纤维细胞筛选了一个已知生物活性的小分子库。通过设计一种针对多基因表达谱的评分方法，研究者发现了一个ATP竞争性VEGFR/PDGFR抑制剂化合物ABT869诱导了人真皮成纤维细胞向脂肪细胞的重编程。这一研究结果为基于细胞表型的高通量药物筛选以及再生医学领域小分子诱导方案或新药的开发提供了更为快速、精确且有效的技术基础。此外，PHDs-seq也有望用于其它需要高通量检测一组基因表达的其它场景，例如基于细胞疾病模型或类器官模型的遗传筛选及疾病机制研究等。

      首先，研究人员建立了一套完整的PHDs-seq建库流程。该过程包括1）开发并优化了一种新型细胞裂解液，使得细胞裂解产物可以直接用于反转录过程，从而免去mRNA的抽提和纯化步骤；2）反转录得到的cDNA产物与带有UMI分子标签的目标基因探针集杂交和连接同步进行；3）用分别带有96孔板的板号和孔号分子标签的引物扩增富集产物；4）将数百个样品混合成一个管，并通过纯化获得PHDs-seq文库；5）利用通用的测序引物对PHDs-seq文库进行测序并分析各标志基因的表达量（图1）  

    作为该技术的应用案例之一，研究人员利用人真皮成纤维细胞向脂肪细胞重编程的系统测试了PHDs-seq的效果。他们首先分离了人瘢痕疙瘩的真皮成纤维细胞，在诱导其向脂肪细胞重编程的体系下收集细胞开展建库测序。聚类和相关性分析结果显示，PHDs-seq测序能准确将诱导样品（阳性）和不诱导样品（阴性）区分开，且阳（阴）性样品之间相关系数高，阳性样品和阴性样品相关系数低。针对同一个基因，两个不同探针检测其表达量有相似的结果（R²=0.9542）。此外，两个重复样品之间也有很高的相关系数（R²=0.97926）。最后，研究人员比较了PDHs-seq和qPCR两种方法在分析同一批次的实验组和对照组之间基因相对表达量的差别。结果表明，两种方法的检测结果有较强的相关性（R²分别为0.8781和0.9272）（图2）。这些结果表明，PHDs-seq有较高的准确性、灵敏性和可重复性。

     本工作得到了国家重点研发计划（2019YFA0110000, 2018YFA0800504）、国家自然科学基金（31922020）、北京大学临床医学+X青年专项（PKU2020LCXQ002）和南京昕瑞再生医药科技有限公司项目的资助。